Магистерская диссертация на тему: Полимеразная цепная реакция ПЦР. Принцип метода полимеразной цепной реакции

Введение

Полимеразная цепная реакция - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последнее десятилетие. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.

Впервые состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь для постановки полимеразной цепной реакции, и основные принципы использования праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) для получения копий ДНК были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году. Однако тогда еще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК как результат реакции.

В 1983 году Kary Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК в миллиарды раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

В этот период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность вплоть до 95° С, что является необходимым условием для проведения полимеразной цепной реакции.

Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода.

Перспективы практического использования ПЦР-диагностики

В настоящее время наиболее быстро развиваются пять основных направлений генодиагностики:

диагностика инфекционных заболеваний;

диагностика онкологических заболеваний;

диагностика лейкемий и лимфом;

диагностика рака груди;

диагностика других злокачественных заболеваний;

диагностика генетических заболеваний;

идентификация личности;

судебная медицина, криминалистика;

трансплантация органов и тканей;

определение отцовства;

диагностика патогенов в пище.

Оглавление

- Полимеразная цепная реакция ПЦР

- Принцип метода полимеразной цепной реакции

- Наличие в реакционной смеси ряда компонентов

- Циклический температурный режим

- Основные принципы подбора праймеров

- Эффект плато

- Стадии постановки ПЦР

- Подготовка пробы биологического материала

- Амплификация

- Оценка результатов реакции

- Метод горизонтального электрофореза

- Метод вертикального электрофореза

- Контроль за прохождением реакции амплификации

- Положительные контроли

- Внутренние контроли

- Методы, основанные на полимеразной цепной реакции

- Качественный анализ

- Способ постановки ПЦР с использованием горячего старта

- Детекция молекул РНК

- Организация технологического процесса постановки ПЦР Заключение

Заключение

Самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ, содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в ранней диагностики ВИЧ-инфекций, вирусных гепатитов и т.д. На сегодняшний день почти нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.