Дипломная работа на тему: Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК

Введение

С возникновением принципиально новых направлений в науке, в клинической диагностике успешно начали применяться методы ДНК-технологий среди которых, безусловно, первое место занимают полимеразная цепная реакция (ПЦР). Не менее мощным и уникальным по своим характеристикам методом является анализ с использованием биологических микрочипов. Этот метод появился сравнительно недавно, но уже интенсивно применяется в практике.

В основе всех ДНК-технологий, лежат процессы амплификации и регистрации молекул ДНК.

Оптимизация условий данных процессов позволит увеличить производительность, снизить стоимость анализа и повысить его качество. Одним из возможных путей решения этого вопроса является объединение в единую технологическую схему современных подходов в детекции ДНК.

В настоящее время возможные применения подобных схем находятся на стадии разработки в ряде зарубежных лабораторий. Наиболее вероятным направлением ближайшего их применения является молекулярная диагностика наследственных заболеваний и другие практические приложения, основанные на выявлении однонуклеотидных полиморфизмов последовательностей ДНК человека.

Цель работы - это попытка создать модель диагностической системы за счет объединения преимуществ двух методов - количественного вида ПЦР - Real Time и биочипового анализа, в связи с чем были поставлены следующие задачи : изготовление микропланшетов с лунками, общий объем которых не должен превышать 2мкл (в настоящее время используются микроплашки с лунками, рассчитанные на 200 мкл), перевод реакции в формат микрочипа и отработка условий ПЦР в микрообъеме (обычно ПЦР ставят в объеме 20-30 мкл,в формате биочипа общий объем реакционной смеси не должен превышать 1-2 мкл).

Работа выполнялась на базе лаборатории клеточной инженерии Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, г. Пущино.

Оглавление

- Введение

- Обзор литературы 1.1 Real Time ПЦР

- Виды RealTime ПЦР

- Кинетические параметры

- Биологические микрочипы

- ДНК-микрочипы

- Гибридизация-основа технологии

- Применение ДНК-чипов Глава 2. Материал и методы

- Изготовление микропланшетов

- Определение спектра поглощения и эмиссии SYBR green

- Протоколы ПЦР

- Постановка реакции с использованием фирменного наборасистемаSYB green

- Постановка реакции без использования фирменного наборасистемаSYBgreen

- Протокол полимеразной цепной реакции с использованием TaqMan

- Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации

- Система детекции результатов анализа Глава 3. Результаты и обсуждение

- Определение зависимости сигнала флуоресценции от концентрации ДНК

- Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках

- Проведение ПЦР в пластиковых микропланшетах

- Постановка ПЦР в микрообъемах с отрицательными контролями

- Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации Выводы

- Заключение

- Список литературы

Заключение

- Созданы экспериментальные образцы микропланшетов, позволяющие проводить полимеразную цепную реакцию в общем объеме ПЦР-смеси - 1 мкл.

- Подобраны условия эффективной полимеразной цепной реакции в объеме реакционной смеси 1 мкл.

- Отработаны условия ПЦР в микрообъеме (1 мкл) - формате биологических микрочипов.

Заключение.

Сейчас без преувеличения можно сказать: развитие "технологии манипулирования с наследственной информацией" сравнимо по темпам роста с микроэлектроникой и информатикой, нередко эффективно сочетается с ними. И только уникальное сочетание преимуществ традиционных методов и технологий приведет человека к решению ранее недоступных задач в этой интересной и перспективной области. Подобные направления позволяют устанавливать структуру и изучать процессы на уровне генов всего генома, белков всей клетки или клеток всей ткани.

В ходе выполненной работы создана система, которая позволила объединить преимущества таких методов как RealTime ПЦР и микрочипового анализа. Внедрение основы этой разработки в медицину может положить начало создания уникальных тест систем и инструментов клинической диагностики. Количественный ПЦР особенно необходим для обнаружения и мониторинга некоторых вирусных заболеваний ( таких как вирусный гепатит С и В, СПИД). Биочип является уникальным устройством, позволяющим проводить одновременно большое количество анализов на одной подложке. Перевод количественного ПЦР в формат чипа сделает анализ быстрым и экономичным.

Список литературы

1. А.Шляпникова, Ю.М.Шляпников, В.Н.Афанасьев, Г.В.Афанасьева, А.В.Гаврюшкин, И.П.Белецкий. "Исследование качества амино-модифицированных подложек, используемых для гибридизационного анализа" Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН. УДК 547.963.3

2. Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Грановский И.Э., Афанасьева,Г.В., Гаврюшкин А.В., Белецкий И.П "Биологические микрочипы в медицине" Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

3. Шишкина И.Г., Левина А.С., Зарытова В.Ф. "Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их фрагменты" // Успехи химии//2001 г. №70(6), с.581,.

4. Иванов, И., Ершов Г., Барский, В., Бельговский, А., Кириллов, Е., Крейндлин, Э., Паринов, С., Мологина, Н., и Мирзабеков А., Äèàãíîñòèêà ãåíåòè÷åñêèõ ìóòàöèé íà îëèãîíóêëåîòèäíûõ ìèêðî÷èïàõ. (1997 г.) Мол. Биол., 31, с. 159-167.

5. "Биочипы в биологии и медицине XXI века" Академик А.Д. Мирзабеков. Выступление на научной сессии общего собрания РАН

6. Барский В., Колчинский А., Лысов Ю., Мирзабеков А. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике // Мол. биол., 2002. Т. 36. С. 563-584.

7. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Министерства Здравоохранения РФ.

8. Л. И. Патрушев "Искусственные генетические системы" Том 1 Москва, Наука, 2004 С.228.

9. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. "Методы развития ДНК-диагностики в клининеческой медицине" Лаборатория генной инженерии и иммуногенетики НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Москва 2003

10. Ekins R.Р. (1987) Аn overview оf present and future ultrasensitive nonisotopic immunoassay development. Clin. Biochem. Revs. 8, 12-22.

11. Bernard Р.S., Pritham G.Н., Wittwer С.Т. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein Е locus аs а model system for genotyping. //Analytycal Biochemistry.-1999. - № 273.- р. 221-228.

12. Coutlee, F., Не Y., Saint-Antoine Р., Olivier С. , Kessous А. Coamplification оf HIV type 1 and beta-globin gene DNA sequences in а nonisotopic polimerase chain reaction assay tо control for amplification efficiency.// AIDS Res. Hum. Retroviruses.-1995.-№ 11.- р.363-371

13. Heid С.А. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-р. 986-994.

15. Sykes Р.J., Neoh S.Н., Brisco М.J., Hughes Е., Condon J., Morley А.А. Quantitation оf targets for PCR by use оf limiting dilution.// BioTechniques.-1995.-№ 13.- р.444-449.

16. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.// Nat Biotechnol.-1996.-№ 14.- р.303-308.

18. Adessi С., Matton G., Ayala G., Turcatti G., Mermod J., Mayer Р. , Kawashima Е. Solid phase DNA amрlification: characterisation оf primer attachment and amplification mechanism //Nucleic Acids Research. - 2000. - Vol. 51. - Nо. 20.

19. Bing D., Boles С., Rehman F., Audeh М., Belmarsh М., Kelley В., Adams С.. Bridge amplification: а solid phase PCR system for the amplificatiоn and detectiоn оf allelic differences in single copy genes //Genetic Identity Conference Proceedings, Seventh International Symposium оn Human Identification. - 1996.

20. Brookes А., Lehvaslaiho Н., Siegfried М., Boehm J., Yuan Y., Sarkar С., Bork Р., Ortigao F. HGBASE: а database оf SNPs and other variations in and around human genes //Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28. - № 1- рр. 356-60.