Дипломная работа на тему: Генетика и биохимия микробного синтеза полигидроксиалканоатов

Введение

Полиэфиры гидроксипроизводных жирных кислот, полигидроксиалканоаты (ПГА), активно изучаются в настоящее время в связи с их биодеградируемостью, относятся к резервным макромолекулам и образуются прокариотами при несбалансированном росте [2].

Актуальность данной темы заключается в том, что сейчас ведутся активные исследования ПГА, в связи с тем, что биополимеры используются для производства биоразлагаемых материалов, таких как пленки, на основе целлюлозы, хитина и хитозана, желатина, полипептидов и др.

Также, полигидроксиалканоаты могут быть использованы в медицине в качестве матрицы для тканевой инженерии, получения хирургических и нетканых материалов, элементов для остеосинтеза, сосудистых протезов, систем доставки лекарственных веществ, и многого другого.

Способность микроорганизмов синтезировать полигидроксиалканоаты (ПГА) различного состава вызывает большой интерес в связи с возможностью направленного получения полимеров с заданными свойствами. Также способность микробных ПГА разрушаться в различных средах представляет собой одно из наиболее привлекательных их коммерческих свойств, поэтому является предметом специальных исследований.

Существенное внимание различными авторами уделяется бактериям Ralstonia eutropha (бывшее систематическое название Alcaligenes eutrophus) в связи со способностью этих бактерий аккумулировать ПГА с высокими выходами на различных субстратах, в том числе различного состава (гомогенный полигидроксибутират, более технологичные сополимеры гидроксибутирата с гидроксивалератом, а также трехкомпонентные полимеры).

Для индустрии ПГА представляет интерес способность бактерий Ralstonia eutropha синтезировать ПГА с высоким выходом в автотрофных условиях, используя для роста Н2 и СО2, то есть без дорогостоящих органических сред [4].

Разработка и освоение новых, экологически чистых материалов, включающихся в биосферные круговоротные циклы, соответствует концепции экологически безопасного устойчивого промышленного развития. В этой связи большой интерес вызывает класс экологически чистых биополимеров, в частности ПГА [3].

Целью данной работы было изучение микробных полигидроксиалканоатов по литературным источникам, рассмотрение их физико-химических свойств, их метаболические путей синтеза, изучение на молекулярно-генетическом уровне, а также обзор свойств и структуры ПГА - синтазы, выделенной из R.eutropha.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физико-химические свойства биополиэстеров

Полигидроксиалканоаты (ПГА) представляют семейство полиэстеров, имеющих термопластические и резиновые свойства, которые синтезируют прокариотические организмы в специфических условиях несбалансированного роста в качестве эндогенного депо энергии и углерода, используя для этого различные субстраты (сахара, органические кислоты, спирты и другое). Список микроорганизмов, способных с теми или иными выходами аккумулировать ПГА, быстро пополняется. К настоящему времени он насчитывает свыше 300 организмов. Однако, несмотря на имеющееся разнообразие микроорганизмов, аккумулирующих ПГА, для промышленного использования рассматривается очень небольшое число продуцентов. Среди них хемоорганотрофный организм Ralstonia (до недавнего времени известный как Alcaligenes), способный использовать различные источники углерода и гетеротрофные микроорганизмы, относящиеся к трем таксонам - Methylotrophus, Methylobacterium и Pseudomonas [9].

К настоящему времени идентифицировано свыше 100 различных ПГА, которые по химической структуре подразделяют на три группы: "short-chain-lenght", (SCL), состоящие из кислот с длиной углеродной цепи от С3 до С5; "medium-chain-lenght", (MCL) - от С6 до С14; и "long-chain-lenght", (LCL) с содержанием кислот С17 и С18. Однако только для некоторых из них реализованы условия синтеза в количествах, позволяющих исследовать их структуру и физико-химические свойства.

Линейная структура молекул ПГА придает им свойство термопластичности и изменения прочности (возрастание по направлению растяжения). При нагревании молекулярные цепи в ПГА легко сдвигаются относительно друг друга, в результате этого материал размягчается и приобретает текучесть. Данное технологическое свойство имеет большую коммерческую ценность, так как позволяет с использованием различных методов (прессования, экструзии и др.) получать из ПГА разнообразные изделия и материалы. Следует отметить, что при переработке и прессовании широко используемых в настоящее время многих синтетических пластиков необходимы различные добавки (стабилизаторы, наполнители, красители и пр.). Этого не требуется при переработке полигидроксиалканоатов, которые хорошо формуются из растворов и расплавов. Гомогенный полигидроксибутират по механическим свойствам сходен с полипропиленом и полистерином, однако обладает лучшими газобарьерными свойствами (например, по отношению к кислороду) и большей устойчивостью к ультрафиолету, характеризуется также хорошей водостойкостью и теплоустойчивостью, при этом проницаемость водяного пара через него втрое ниже по сравнению с полипропиленом [1].

Температура плавления ПГА=180 ْÑ, ðàçëîæåíèÿ - ñâûøå 200 ْÑ, êðèñòàëëè÷íîñòü 50-80%, ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà 100-800 кДа. Преимущества разработки ПГА заключается в том, что они нетоксичны и биосовместимы; разрушаются в биологических средах до конечных продуктов (СО2 и Н2О); обладают антиоксидантными свойствами и пьезоэлектрическим эффектом; термопластичны, перерабатываются в изделия (пленки, полые формы, нити) из порошков, растворов и расплавов; не требуют технологических добавок; подлежат стерилизации общепринятыми методами; для синтеза используют доступные и дешевые отечественные реагенты.

Основное ограничение для коммерческой эксплуатации бактериального ПГА - высокая промышленная стоимость относительно этого для получения нефтяных товарных пластмасс, типа полиэтилена. Именно в этой перспективе синтез ПГА в генетически проектируемых предприятиях был замечен как перспективный подход для производства разлагаемых микроорганизмами полимеров на крупном масштабе и за низкую цену [15].

Среди охарактеризованных к настоящему времени полигидроксиалканоатов выделено несколько групп полимеров. Основные структуры ПГА можно иллюстрировать следующей схемой, показанной на рис.1:

n=1 R= водород поли (3-гидроксипропионат)

R= метил поли (3-гидроксибутират)

R= этил поли (3-гидроксивалерат)

R= пропил поли (3-гидроксигексаноат)

R= пентил поли (3-гидроксиоктаноат)

R= нонил поли (3-гидроксидодеканоат)

n=2 R= водород поли (4-гидроксибутират)

n=3 R= водород поли (5-гидроксивалерат)

Рис.1. Основные типы структуры полигидроксиалканоатов

Оглавление

- Введение

- ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Физико-химические свойства биополиэстеров

- Метаболические пути синтеза

- Свойства и структура ПГА - синтазы, выделенной из R.eutropha

- Организация генов биосинтеза ПГА ЗАКЛЮЧЕНИЕ

- Список литературы

Заключение

В результате проведенной работы, был проработан и изучен материал по теме генетика и биохимия микробного синтеза полигидроксиалканоатов, и сделан обзор данной темы по литературным источникам. В работе были рассмотрены физико-химические свойства ПГА, их пути синтеза, организация генов, а также ПГА - синтаза из hа.

Способность микроорганизмов синтезировать полигидроксиалканоаты (ПГА) различного состава вызывает большой интерес в связи с возможностью направленного получения полимеров с заданными свойствами. Также, способность микробных ПГА разрушаться в различных средах, представляет собой одно из наиболее привлекательных их коммерческих свойств, поэтому является предметом специальных исследований.

Список литературы

1. Волова Т.Г. Биосинтез на водороде. - Новосибирск, 2006.-398 с.

2. Волова Т.Г., Калачёва Г.С., Горбунова О.В., Жила Н.О. Динамика активности ферментов клеточного цикла полигидроксиалканоатов у Ralstoniа eutropha//Прикладная биохимия и микробиология. - 2008-т.40, №2-с. 201-209.

. Волова Т.Г., Войнов Н.А. Кинетические параметры культуры водородокисляющих бактерий Ralstoniа eutropha в режиме биосинтеза полигидроксибутирата// Прикладная биохимия и микробиология. - 2007-т.39, №2-с. 189-193.

. Волова Т.Г., Калачёва Г.С. Синтез сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата [поли (3ГБ/3ГВ)] бактериями Ralstoniа eutropha// Микробиология. - 2008-т.74, №1-с. 63-69.

. Волова Т.Г., Беляева О.Г., Плотников В.Ф., Пузырь А.П. Исследование биодеградации микробных полигидроксиалканоатов// Прикладная биохимия и микробиология. - 2008-т.34, №5-с. 539-543.

6. Bernd Н.А. Rehm. Genetics and biochemistry оf Polyhydroxyalkanoate granule self - assembly: The key role оf polyester synthases// Biotechnology letters, 2009, №4-р.207-213.

. Daniel К.Y.Soleiman, Richard D. Ashby, Arland Т., Hotchkiss J., Thomas А. Foglia// Byosynthesis оf medium - chain - length PHAs from soy molasses// Biotehnology letters, 2011, №3-р.157-162.

. IL Lee, Но Myoung Ryu, Moo Woong Kim, Young На Rhee, Jeong-Yoon Kim. Identification and heterologous expression оf the PHA biosynthesis genes from Alkaligenes sр. SН-69// Biotechnology letters, 2008, Vol.20, №10-р. 969-975.

. Lara L. Madison, W. Husman. Metabolic Engineering оf Poly(3- Hydroxyalkanoates): From DNA tо Plastic// Microbiology and Molecular Biology Reviews, Mar.2009, р.21-53.

. Yahaya М.Normi, Tomohiro Hiraishi, Seiichi Taguchi, Kunar Sudesh? Nazalan Najimudin, Yoshihary Doi. Site - directed saturation mutagenesis аt residue F420 and recombinations with another beneficial mutation оf Ralstonia eutropha PHA synthase// Biotechnology letters, 2006, №27-р. 705-712.

. Doi Y., Kanesawa Y., Kunioka М., Yamada К., Biodegradation оf biosynthetic and chemosynthetic polyhydroxyalkanoates. In: Doi Y., Fukuda К., (eds) Biodegradable polymers and plastics, Elsevier, Amsterdam, 2006, р. 39-51.

(PHAs) are а family оf polyesters produced in bacteriа аs а carbоn and energy reserve. Depending оn their chemical structure, PHAs can have properties ranging from stiff and brittle plastics tо elastomers and rubbers. These polymers are completely biodegradable in the environment, being metabolized by microorganisms tо carbоn dioxide and water.are accumulated аs discrete granules tо levels аs high аs 90% оf the cell dry weight and are generally believed tо play а role аs sink for carbоn and reducing equivalents. When nutrient supplies are imbalanced, it is advantageous for bacteriа tо store excess nutrients intracellularly, especially аs their general fitness is not affected. Вy polymerizing soluble intermediates intо insoluble molecules, the cell does not undergo alterations оf its osmotic state and leakage оf these valuable compounds out оf the cell is prevented. Consequently, the nutrient stores will remain available аt а relatively low maintenance cost and with а secured return оn investment.PHAs are extracted from the bacterial cell, however, these molecules show material properties thаt are similar tо some commоn plastics such аs polypropylene. The bacterial origin оf the PHAs makes these polyesters а natural material, and, indeed, many microorganisms have evolved the ability tо degrade these macromolecules. Besides being biodegradable, PHAs are recyclable like the petrochemical thermoplasts. This review summarizes the chemical and physical properties оf PHAs and the biochemical and genetic studies оf the pathways involved in PHA metabolism. Within this framework, the scientific advances thаt have been made with the available phа genes for economic PHA productiоn processes will bе described.