Решение задач на тему: Целью работы являлась идентификация генов изоцитратлиазы в прорастающих семенах арабидопсиса. Было

Введение

Длительное время подвергается изучению глиоксилатный цикл растений, обеспечивающий растения интермедиатами при конверсии запасных липидов, а также в зеленом растении участвует в превращении токсичных продуктов фотодыхания в безвредные вещества, используемые в конструктивном метаболизме. Ключевым ферментом глиоксилатного цикла является изоцитратлиаза.

Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма является одной из важнейших задач современной биологии. Оно имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования организма.

Изучение структурно-функциональной организации и молекулярных механизмов регуляции ключевого фермента глиоксилатного цикла - изоцитратлиазы, является актуальной проблемой современной биохимии растений.

Глава 1. Обзор литературы

.1 Общая характеристика глюконеогенеза

Биосинтез глюкозы и других углеводов из более простых предшественников является в количественном отношении наиболее важным процессом в биосфере. Точно также как превращение глюкозы в пировиноградную кислоту, катализируемое ферментами гликолиза, является центральным путем катаболизма углеводов в большинстве клеток как в аэробных, так и в анаэробных условиях, также обратный процесс - превращение пирувата в глюкозу - является наиболее важным общим путем биосинтеза моно- и полисахаридов. В этот центральный биосинтетический путь вливаются два главных "питающих пути": один из них из ряда реакций, посредством которых интермедиаты ЦТК, лактат, большинство аминокислот, пропионат превращаются в пировиноградную кислоту [рис.1] [этот процесс, протекающий у всех организмов называется глюконеогенезом]; второй важный путь состоит в восстановлении СО2 до глюкозы [этот путь является отличительной особенностью автотрофов].

Глюконеогенез реализуется путем обращения некоторых стадий гликолиза, однако в гликолитическом пути имеются три необратимых стадии, которые не могут использоваться при превращении пирувата в глюкозу, поэтому используются альтернативные реакции [обходные пути], которые термодинамически благоприятствуют синтезу глюкозы.

Первый обходной путь у некоторых животных требует совместного действия цитозольных и митохондриальных ферментов. Реакция, осуществляемая под действием митохондриальной пируваткарбоксилазы, выглядит следующим образом [рис.1]:

глюконеогенез ген белок изоцитратлиаза

ПВК + СО2 + АТФ + ацетил-КоА = ОАА + АДФ + Фн

Пируваткарбоксилаза - регуляторный фермент, который в отсутствии ацетил-КоА почти полностью лишен активности, так как данный метаболит выступает в роли положительного регулятора. Оксалоацетат, образующийся в этой реакции, восстанавливается, а затем в митохондриях трансформируется в малат. Малат, диффундируя в цитоплазму при участии специальной декарбоксилатной транспортной системы, находящейся во внутренней митохондриальной мембране, окисляется цитоплазматической НАД-зависимой МДГ с образованием внемитохондриального ОАА.

Рис.1. Схема глюконеогенеза: красным выделены ферменты, осуществляющие обходные пути при синтезе глюкозы.

Под действием фосфоенолпируваткарбоксикиназы [Мn2+ - зависимая реакция, в которой донором фосфата служит ГТФ или АТФ] щавелевоуксусная кислота распадается на ФЕП и углекислый газ:

ОАА + ГТФ (АТФ) = ФЕП + СО2 + ГДФ(АДФ)

Фосфофруктокиназная реакция гликолиза необратима, поэтому второй обходной механизм биосинтеза глюкозы достигается при помощи фермента фруктозодифосфотазы, осуществляющим необратимый гидролиз 1-фосфатной группы: Фр-1,6-бис-фосфат + Н2О = Фр-6-Ф + Фн. ∆G0= -3,9ккал/моль.

Для проявления активности фруктозодифосфотазы необходимы ионы Мg2+ и положительный модулятор - АТФ. Данный фермент резко ингибируется отрицательным модулятором - АМФ [5].

На третьем обходном пути вместо гексокиназы, работающей в гликолизе, в глюконеогенезе участвуют глюкозо-6-фосфотаза [Мg2+-зависимый фермент][рис.1].

Таким образом, суммарное уравнение реакции, ведущей от ПВК к свободной глюкозе следующее:

ПВК + 4АТФ + 2ГТФ + 2НАДН + 6Н2О = Глюкоза + 2НАД+ +4АДФ +2ГДФ + 6Фн

Субстратами глюконеогенеза выступают также промежуточные продукты ЦТК. Главными из них являются интермедиаты, способные окисляться в малат.

Аминокислоты, служащие предшественниками ФЕП называются гликогенными. Лейцин и некоторые другие аминокислоты являются кетогенными, т.е. способны трансформироваться в ацетоацетат. Фенилаланин, тирозин относятся к смешанным аминокислотам, способным выполнять и кето- и гликогенные функции.

У микроорганизмов и растений субстратами глюконеогенеза выступают жирные кислоты и ацетил-КоА, способный вовлекаться в реакции глиоксилатного цикла.

Оглавление

- Введение

- Обзор литературы .1 Общая характеристика глюконеогенеза

- Глюконеогенез в растения

- Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенез Е

- Характеристика структуры гена и белка ИЦЛ Глава 2. Экспериментальная часть

- Цели и задачи

- Объекты и методы исследования

- Объект исследования

- Методы исследования

- Результаты и их обсуждения

- Динамика активности изоцитратлиазы

- Идентификация генов icl 1 и icl

- Выводы

- Литература

Заключение

.Изучена динамика активности ИЦЛ при прорастании семян арабидопсиса и показано, что исследуемый фермент имеет максимальное значение активности на 4 день прорастания. Вероятно, в данный период осуществляется активная утилизация запасных липидов через глюконеогенез.

2. Применение олиго-dТ праймера в качестве затравки при проведении реакции обратной транскрипции, дало возможность получить набор кДНК к матричной РНК из семян арабидопсиса, пригодных для дальнейших анализов.

3. Методом ОТ-ПЦР, с использованием специфических праймеров к генам изоцитратлиазы, установлено, что в семенах активно транскрибируются два гена - icl1 и icl2. Вероятно, в процессе развития организма происходит экспрессия генов ИЦЛ, обеспечивающей протекание глиоксилатного цикла в растительной клетке, при конверсии липидов в углеводы.

Список литературы

1. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. // М., 2012. - 446с.

. Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации?/ А.Т Епринцев., В.Н Попов., М.Ю. Шевченко //М.: ИКЦ "Академкнига", 2007.- 228 с.: ил.

. Попов В.Н. Сравнительный анализ ключевого фермента глиоксилатного цикла, изоцитратлиазы, из организмов разных систематических групп / В.Н.Попов, Е.А. Москалёв, М.Ю.Шевченко, А.Т. Епринцев // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2009. - №6.- С.317-329.

. Страйер Л. Биохимия - М.: Мир, 1984. - Т.1.-232 с.

. Филлипович Ю.Б. Основы биохимии. - М.: Высш. шк. 1993.- 496 с.

6. Blackburn Р. Ribonuclease inhibitor from human placenta: interaction with derivatives оf ribonuclease А / Р. Blackburn, В.L. Jailkhani // J Biol Chem. - 2009. - vol. 254. - рр. 12488-93.

. Carpenter W.D. Distributhion and properties оf isocitritase in plants/ W.D. Carpenter Н. Beevers//Plant Physiol.-2009.-Vol.34,№4.-Р.403-409.

. Chomczynski Р. Single-step method оf RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction extraction /Р. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 2007. - vol. 162. - рр. 156-159.

. Cioni М. Comparative biochemistry оf glyoxylate cycle / М.Cioni, G.Pinzauti, Р. Vanni // Comp.Biochem. and Physiol.-1981.- V.70, В, N 1.-Р.1-26.

. Cioni М., Comparative biochemistry оf isolation by acid guanidinium glyoxylate cycle / М. Cioni, Р.Vanni // Comp.Biochem. and Biophis. - 2012, Vol. 70, Р. 2621-2629.

. Davis W.L.Cytochemical localization оf malate synthase in amphibian fat body adipocytes:possible glyoxylate cycle in а vertebrate / W.L.Davis, R..G.Jones, D.В. Goodman // J.Histochem.Cytochem.-2006.-Vol.34,№5.-Р.689-692.

. Davis W.L. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver / W.L.Davis, D.В. Goodman // Source Anatomical Record.-1992.-V.234,№4.-Р.461-468.

. Firenzuoli А.М. Enzymes оf glyoxylate cycle in conifers / А.М.Firenzuoli, Р.Vanni, Е.Mastronuzzi, А. Zanobini, V.Baccari // Plant Physiol.- 1968.-Vol.43, №7.-Р.1125-1128.

. Gemmrich А.R.Isocitrat lyase in germinating spores оf the fern Anemia Phillitia / А.R Gemmrich // Phytochemistry.-2009.-Vol.18,№6.-Р.1143-1146.

. High-efficiency cloning оf full-length cDNA; construction and screening оf cDNA expression libraries for mammalian cells / Н. Okayama [еt аl.] // Methods Enzymol. - 1987. - vol. 154. - рр. 3-28.

. Holmes R.Р. The absence оf glyoxylate cycle enzymes in rodent and embrione chick liver // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. - Vol.233.- Р.123-138.

. Jameel S.Н., Caenorhabditis elegans: purification оf isocitrate lyase and the isolation and cell-free translation оf poly (А+) RNA./ S.Н. Jameel, В.McFadden //Exp. Parasitol. -1985.- Vol.59.- Р.337-346.

. Jones J.D. The glyoxylate cycle: does it function in the dormant оr active bear?/ J.D. Jones, Р.Burnett, Р. Zollman // Comp. Biochem. Phisiol. В.- 1999.- Vol. 124.- Р.177-179.

. Kamel М.Y.Biochemical studies оf tick embryogenesis. Purification and partial characterization оf isocitrate lyase from eggs оf the tick.Hyalomma dromedarii / М.Y.Kamel, А.S.Fahmy // Comp.Biochem.Physiol.В/-1982.-Vol.72.-Р.107-115.

. Kornberg Н.L.Synthesis оf cell Constituents from С2-units by а modigied tricarboxylic acid cycle / Н.L.Kornberg, Н.А.Krebs // Nature.-2007.-Vol.179.-Р.988-991.

. Liu F. Bifunctional glyoxylate cycle protein оf Gaenorhabditis elegans: а developmentally regulated protein оf intestine and muscle. / F. Liu, J.D.Thatcher, J.М. Barral // Dev.Biol.-2012/-Vol.169.-Р.399-414.